核酸染料加的多少对dna有影响吗

didi 2024-05-14 18:33:04

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电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：
1、溴化乙锭（ethidium bromide, eb）
最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 eb-dna复合物中的eb发出的荧光，比游离的凝胶中的eb发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若eb背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/lmgso4中1h或10mmol/l mgcl2中5min，使非结合的eb褪色，这样可检查到10ng的dna样品，eb也可用于检测单链dna或rna，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。
在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的eb，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但eb带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的eb水溶液中10min进行染色。eb见光易分解，应于4℃避光保存，
2、吖啶橙（acridine orange, ao）：
吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/l磷酸钠缓冲液（ph7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。
3、银（ag+）试剂：
ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使ag+还原成银颗粒。agno3等试剂可使聚**凝胶上的单链，双链dna及 rna都染成黑褐色。银染法的灵敏度比eb染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 rna，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对dna的染色定量不准确。银与dna稳定结合，对dna有破坏作用，不适于dna 片段回收的制备。
4、亚甲蓝（methylene blue）
可将rna染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/l tr**-ac（ph8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。 20210311

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