引物合成

田鹏 2024-05-31 08:51:08

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17.长链引物为什么出错的几率非常高？答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基**，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如pcr扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶pcr扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。18.如果测序发现突变，该如何处理？答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取**测序，您可能会找到正确**的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个**就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个**突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。19.如果测序发现引物突变，是否有补偿？答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%。您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。20.引物是经过page纯化的，为什么还有碱基缺失或**？答：理论上分析型page变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备page电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，page纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少od数，引物遇到的问题可能就会少一些。21.为什么opc或page纯化的引物，再用hplc鉴定纯度不高？答：有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将hplc鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。问题来了，还有那30%是什么？引物纯化page,需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用c18浓缩，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰引物的使用。opc纯化也类似的情况。即使是hplc纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。22.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?答：主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要page或hplc纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。23.taqman 探针设计的基本原则是什么？答：下列原则供您参考。taqman 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。长度一般为18-40mer。g-c含量控制在40-80%左右。避免连续相同碱基的出现，特别是要避免gggg或更多g出现。在引物的5’端避免使用g。选用比较多的碱基c。退火温度tm控制在 68-70c左右。有用的荧光染料参数
name name 吸收波长发射波长 colors
6-fam 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm green
tet 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm orange
hex 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm pink
tamra tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm rose
rox 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm red
cy3 indodicarbocyanine 552nm 570nm red
cy5 indodicarbocyanine 643nm 667nm violet
24.primer设计的基本原则是什么？答：引物设计的下列原则供您参考。引物长度一般在18-35mer。g-c含量控制在40-60%左右。避免近3’端有酶切位点或发夹结构。如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的g或c。如果可能避免在3’端最后1个碱基为a。避免连续相同碱基的出现，特别是要避免gggg或更多g出现。退火温度tm控制在 58-60c左右。如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 20210311

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