冷冻切片的步骤

康啵得儿 2024-05-26 12:22:19
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1取材应尽可能快地采取新鲜的材料,防止组织发生死后变化。2速冻1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm)。2、如组织块小可适量加oct包埋剂浸没组织,将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。4、在制成冻块,可置入恒冷箱切片机冰冻切片。5、若需要保存,应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-80℃冰箱贮存备用。3固定1、样品托上涂一层oct包埋胶,将速冻组织置于其上,4℃冰箱预冷5-10min让oct胶浸透组织。2、取下组织置于锡箔或者玻片上,样品托速冻。3、组织置于样品托上,其上再添一层oct胶,以完全覆盖为宜,速冻架(pe)上30min。4切片1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机,其基本结构是将切片机置于低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至5-10μm。2、切片时,低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜,温度过低组织易破碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。3、切好室温放置30min后,入4℃**固定5-10min,烘箱干燥20min。pbs洗5min×3。4、进行抗原热修复,微波热修复也可,室温自然冷却。可用3%h2o2孵育5-10min,消除内源性**物酶的活性。5免疫荧光染色1、冰冻切片室温晾干15min,可用含10%正常山羊血清的pbs室温封闭切片1小时(此步可不洗)。2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定,原则是可以均匀覆盖组织面,且保证整个过程中不会使组织干涸)。3、将切片放在加了pbs的免疫组化湿盒,室温孵育2小时或4℃过夜。4、第二天将湿盒放到37℃回温1h,吸取片上的一抗进行回收,将切片插入到小染缸pbs冲洗。5、滴加用pbs稀释好的二抗(避光)置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗,切片置于染缸内,pbs洗5min×3次。6、滴加dapi工作液染核,室温10-20min(工作浓度0.1%染色15min)。7、回收dapi,滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶,用处理干净的盖玻片封片,即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。8、做好的切片放在切片盒内,置于4℃冰箱,可保存一周左右。end 20210311
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