试述缺口平移法标记探针的原理及过程

Super wang 2024-05-15 07:49:10
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此标记反应体系的主要成分有dna酶i,大肠杆菌dna聚合酶,3种三磷酸脱氧核糖核苷酸如datp、dttp、dgtp,一种核素标记的核苷酸32p—dctp,待标记dn**段。在极微量dna聚合酶的作用下,在双链dna分子的一条链上随机切开若干个缺口而不是切断dna或将其降解,然后,大肠杆菌dna聚合酶i在切口的3’—oh端逐个加入新的核苷酸,同时由于该酶具有5,—3’外切酶的活性,它同时切除5,端游离的核苷酸,3’端核苷酸的加入和5,端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着dna链移动。新链核苷酸的合成是以另一互补链为模板,按碱基互补的原则合成,所以新旧链的核苷酸序列完全相同。由于反应体系中含有一种或两种核素标记的单核苷酸,使新合成的链带有核素标记,所以缺口平移实际上是核素标记的核苷酸取代了原dna链中不带核素的同种核苷酸。dnasei是在两条链的不同部位随机打开缺口,从而使两条链都被核素均匀地标记,使得标记的dna具有较高的放射比活性。 20210311
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