药典中水蛭测定中，滴加凝血酶至凝固是什么意思

张小露 2024-05-30 17:54:04

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水蛭（hirudo）为水蛭科动物蚂蟥（whitmaniapigrawhitman）、水蛭（hirudonipponicawhitman）或柳叶蚂蟥（whitmaniaacranulatawhitman）的干燥全体，具有、逐瘀、通经作用，用于症瘕痞块、血瘀经闭、跌扑损伤［1］治疗。作为常用的活血化瘀中药，水蛭在临床广泛用于脑血栓、冠心病、脑水肿等疾病的治疗，其有效成分主要为一种抗凝血物质，名为水蛭素（hirudin）。它能阻止凝血酶对血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而释放，从而延缓或阻止血液的凝固［2］。研究表明，水蛭素是由65个氨基与3个二硫键组成的多肽，分子量约为7000［3］，在干燥状态下稳定存在;室温下，在水中稳定存在6个月，80℃下加热15min不被破坏;提高溶液的ph值，其稳定性下降;20℃下，在0.1mol/l的hcl或naoh中可稳定15min［4］。水蛭素与凝血酶的亲和力极强，1μ**蛭素可中和5μg凝血酶，相应摩尔比为1∶1，即中和一个国际单位（nih单位）的凝血酶需要一个抗凝单位（iat-u）的水蛭素。根据以上摩尔比，以水蛭素含量为指标，对不同浓度、温度及提取时间的水蛭提取物进行比较，选择最佳工艺路线，并确定水蛭提取制备工艺。1材料与方法1.1实验材料1.1.1仪器sigma单道移液器；re-52a型旋转蒸发器（上海亚荣公司）；sigma4k15高温冷冻离心机；自动酸碱滴定仪dl53mettlertoledoswitzerland。1.1.2药物与试剂水蛭购于北京松兰中药饮片有限公司，经北京松兰中药饮片公司主任中药师蔡长德鉴定为水蛭科动物蚂蟥干燥全体；纤维蛋白原（fibrinogen）:sigma;凝血酶（thrombin）:sigma。1.2实验方法1.2.1水蛭素的测定方法取纤维蛋白原0.25g，溶于50ml的tr**-hcl缓冲液（ph≈8）中，得0.5%的纤维蛋白原溶液。稀释凝血酶到5nih/ml。取0.2ml纤维蛋白原溶液，加入20μl水蛭素提取液，并加入凝血酶至凝固，得水蛭素含量=（凝血酶浓度×凝血酶用量）/水蛭素提取液体积。1.2.2乙醇浓度的选择称取水蛭粗粉10g，分别用不同浓度的乙醇进行提取，乙醇的含量为0，30%，50%，70%，90%，提取温度定为60℃，提取时间1.5h，过滤，回收乙醇，样品定容为25ml。分别测定样品中水蛭素含量。水蛭素的测定可依据其与凝血酶按1∶1结合的原理，采用以上方法测得。1.2.3温度条件的选择由于水蛭素只能在80℃下稳定存在15min，所以在选取温度时，应尽量避免温度过高造成水蛭素失活。所以本实验选用在50℃，60℃，70℃下分别进行。称取水蛭粗粉10g，采用70%的乙醇于3个温度各提取1.5h，并采用同样的方法测定水蛭素含量。1.2.4提取时间的选择称取水蛭粗粉10g，用70%的乙醇，在60℃下分别提取1h，1.5h，2h。分别测定提取样品的水蛭素含量。2结果2.1乙醇浓度的选择从表1的数据可以看出，不同浓度的乙醇对水蛭的提取效果有较大的影响。从水蛭素的含量来看，随乙醇浓度的提高，其含量不断增加，在70%~80%的乙醇浓度下，获得较好的提取效果。由于水蛭素是一种可溶于水和乙醇等**的蛋白质，所以综合两种因素考虑，70%~80%的乙醇浓度是较好的提取浓度。表1不同浓度乙醇的提取结果 20210311

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