具体合成由下列几个循环组成: 分析hplc使用柱子和泵系统,可以经受传递高压,这样可以用极细的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。hplc分两类:离子交换和反相。 离子交换hplc依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定ph范围带有特定电荷衍变成一种离子体,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用,通过可变ph, 离子强度, 或两者洗脱出多肽,通常, 先用低离子强度的溶液,以后逐渐加强或一步一步加强,直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性ph中带正电来分离。
反相hplc条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上,用降低离子强度洗脱, 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成,这种链长度为g4-g8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的, 高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而,总体实践中, 这两类柱互变无多少显著差别,别类载体由碳水化合物构成, 比如苯基。
典型的操作常由两绶冲剂组成,0.1%tfa-h2o和80% acetonitrile 0.1%tfa--h2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)
大量各种缓冲剂含许多不同试剂,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸, 稀he formic酸(5-6%, ph2-4), 10-100mm nh4hco3, 醋酸钠/氨,tfa/tea,磷酸钠或钾,异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂,但要注意一点:硅反相柱料不能长时间暴露于高ph,甚至微碱ph, 因为这样会破坏柱子。
不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%, 而肽含量相关带电基团(如arg, lys )的抗离子量和肽亲水性决定。这是合成肽的本身特性。
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