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本人想搞尿激酶的生产，请求帮助,谢谢！

heartTFBOYS 2024-04-29 18:44:58
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尿激酶是从男性尿中提取的一种生化**物，广泛应用于治疗新鲜血栓性闭塞性疾病、肺栓塞、急性脑血栓形成，脑血管栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。我国由于人口众多，资源丰富，劳动力价格低廉，因而尿激酶粗品的生产遍及全国各地。在生产的尿激酶粗品中，仅有一部分经过精制成精品出口，不少粗品直接出口，让外商赚取了大量的利润。研究纯化尿激酶的技术与方法以及提高纯化过程中各道工序尿激酶的收率，提高尿激酶产品的高附加值，利用再生资源，出口创汇，利国利民，具有显著的经济与社会效益和重要意义。一、主要材料
尿激酶粗品(硅胶法生产)，甘氨酸(c·p)、硫酸(a·r)、**(a·r)、**
(a·r)、磷酸二氢钠(c·p)、磷酸氢二钠，**(a·r)，714树脂，cm一s。二、试验过程与技术条件
(一)解析
1.取尿激酶粗品200克(经测定，比活为325iu/mgp)，悬浮于8倍量的。sm甘氨酸缓冲液中，尿激酶浓度在45ooiu/ml，维持低温，搅拌75分钟，静置45分钟，上清液经虹吸与底部沉淀分开。2.虹吸上清液后的沉淀加入1倍量的甘氨酸缓冲液，处理同上，取上清液.
3.合并两次上清液，在低温下缓慢加入snh:50.调phlo.士。1(取样测定价).
(二)714树脂脱色
1.按解析液效价每亿单位用1.4kg树脂上柱，树脂用蒸馏水洗几个床体积后备用。2.将ph10·。的解析液上柱，流速控制在1.8~2.oml/cmz分，收集**液，上柱完毕后，柱用一个床体积的低温蒸馏水洗涤.
3.合并柱**液用snhzso‘调ph为10.0士0.1.
(三)超滤处理
1.将ph为10.的脱色液用超滤器超滤脱盐，超滤浓缩至原体积的六分之一左右。2.浓缩液中加入低温蒸馏水，稀释至电导4.**v(10℃)。3.再次浓缩至六分之一体积。4.二次浓缩液中加人低温。18m、ph6.8磷酸缓冲液及蒸馏水稀释至原体积，二者加入的比例应使稀释液电导为4.8士0.lmv(10℃时)。5.再用snhzso.调ph为6.8士0.1。6.再次校正电导为4.8士。lmv(10℃)。(四)cm一s交换凝胶纯化(在低温下进行)
1.cm一s预处理:cm一s用燕馏水浸泡后，分别用na0h和hcl处理，然后用0.18m、
ph6.8磷酸缓冲液平衡，过滤;平衡过的cm一s悬浮于含0.08%nan:，0.18m、ph6.8磷酸缓冲液中，低温冷藏。2.cm一s吸附
(1)经超滤ph6.8电导4.**v的尿激酸溶液，按skg/亿单位加入经平衡的cm一s，搅
拌两小时，防止起泡，静置一小时，虹吸去除上清液。(2)吸附尿激酶的cm一s上有机玻璃柱，防止柱内起泡，柱面平整.
3.洗涤去除杂蛋白
(1)cm一s上柱后用含0.3%nan3，ph6.8、0.18m磷酸缓冲液洗涤，流速为1.8~
2.。而/cmz分左右，流至**液效价低于10oiu/耐，28onm光吸收峰低于。04e/已。(2)改用1.smph6.8磷酸缓冲液洗涤一个半床体积，流速不变，**液280nm吸收峰应降至0.03以下。4.尿激酸洗脱
(1)洗涤完毕后用0.08mp、h8.8磷酸氢二钠、0.95m氛化钠缓冲液洗脱，流速。4ml/cmz分，测定**液效价及280nm吸收峰，将有活力**液合并，使混合液浓度在s000in/ml以上。(2)混合液调ph6.7.0.抽取试样化验后，装于二升的塑料瓶内，干冰速冻，一22℃以下低温保存。(五)尿激酸〔uk)效价和比活的测定
1.测试原理
(1)主要试剂与器材
恒温水浴锅、刻度闹钟、荧光灯、uk效价坐标纸、牛凝血酶(t)、牛纤维蛋白溶酶原(pg)、牛纤维蛋白(fg)、uk标准品、barbiton一na，tri。nazedta，nael
(2)试剂配制
t:牛凝血酶40bp(****品生物制品检验所)，每支加6.6mlbarbiton一na缓冲液。pg:牛纤维蛋白溶酶原22bp(****品生物制品检验所)，每支加24mltr**缓冲液。pg一t:取pg6.6nil与配好的6.耐t等体积混匀，放入50血三角烧瓶中，扎口备用。fg:片纤维蛋白原，12**p(****品生物制品检验所)，每支加18mlbarbiton一na
缓冲液。(3)标准uk稀释
将标准品(loooiu/支)用**溶液稀释成60in/ml。(4)绘制标准曲线
①取5时试管4支，作记号并分别加入fgo.3耐;②分别加入稀释标准uk溶液0.4、0.3、0.2、0.lm卜
③分别加**溶液0.6、0.7、0.3、0.9回;④分别加入0.4mlpg一t，摇匀，立即放入37℃恒温水溶锅，记时;⑤观察气泡上升情况，体积一半时记终止时间;⑥以单位效价为横坐标，时间为纵坐标，绘制标准曲线，要求至少有三点在一条直线上。(5)样品检测
①继标准曲线后，在同一条件下，同一试剂情况下，进行样品检测;②分别加fgo.3ml，**缓冲液0.gml，pg一to.4mh
③其余步骤同前。(6)测o.d值
将加酸后的样品稀释10倍，然后测其o·d值。(7)计算效价与比活
①根据测试样品的气泡上升时间，在标准曲线上找出相应的点的效价，乘以20得出样品
实际效价。②总效价~单位效价(iu/mdx总体积(ml)
③比活~平均效价xl.75/0·d
2.对产品收率和比活的测定
①对解析液进行总效价和比活测定，结果如下:
总效价:2489万单位，比活:325iu/mgp
②精制后总效价和比活
总效价:1082万单位;比活:”660iu/mgp
③精制收率:41%
三、讨论
1.尿激酶通常以两种分子形式存在，即分子量36。和54000，大分子量的尿激酶活性
较小分子量尿激酶活性强得多，提高比活，一是要去除杂蛋白，二是要除去小分子量尿激酶。分离出的小分子量尿激酶可以另作回收纯化处理。2.尿激酶作为一种活性物质，在纯化过程中要注意防止失活。我们在研究过程中，先是
熟练地掌握尿激酶效价和比活的测定步骤，然后不断改变操作条件，通过对每一道工序中影
响尿激酶收率、比活提高因素的研究，逐步摸索出最佳技术条件。3.对cm一s吸附后的母液及cm一s洗脱液中效价大于200iu/ml的部分要进行超滤盐
析回收，可用作粗品投料。用于提取尿激酶的男性尿液，其ph值，电导为20~3omo一’，细菌总数
个/ml，用3n**调ph~8·5一9.加入硅藻土吸附并沉淀后，滤取硅藻土，用清水搅拌洗涤，甩干装入交换柱，用**淋洗，在洗脱液中加入饱和磷酸二钠,调ph=8.0，再加氯化钠调电导至22mn，通过季钱乙基，交联聚糖凝胶层析柱，再用磷酸缓冲液洗脱，合并**液与洗脱液，加醋酸调ph一4.2，调电导至16~17mn一’，通过甲基纤维素层析柱，用**洗脱，收集洗脱液，加水透析，经离心分机冷冻干燥得到尿激酶成品。上述得到的仅为尿激酶粗品，还可用右旋糖配、肝素、人血清白蛋白等加以修饰精制，以增强其生化稳定性，延长在人体内的作用时间。除用上述分离法制取尿激酶外，还可以采用中性蛋白酶降解的办法制取尿激酶。国外还有采用dna重组的办法，在大肠杆菌中培植尿激酶原。在提取尿激酶的同时还可利用剩余尿液提取人尿白蛋白.
尿激酶属碱性蛋白酶无抗原性，无毒性和其它副作用，可临床用于肺栓塞、冠心病、脑血栓、心肌梗塞、玻璃体混浊、眼底出血、颅内血肿、静脉栓塞以及急
(慢)性肾小球肾炎等疾病的治疗，还可用于治疗纤维蛋白沉着引起的疾病，并可用作**辅助**物。此外，尿激酶还可用来开发保健饮料、太空饮料及化妆品等。作为乡镇企业，开发尿激酶产品，不仅投资少，效益高，能耗低，且原料易得，工艺简单，无毒无害无污染，值得大力提倡. 20210311
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