【求助】哪种方法建立的全长cdna文库质量最好？

以亦 2024-05-29 06:27:17

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做相同工作的战友们一起讨论一下吧。最好给介绍一下彼此的。这个盒子本身有一些缺陷，你发现没有在他已经构建好的cdna文库中没有肺的文库，而我恰好是构建肺的文库，即使在rna很好的前提下都不是很亮，这个盒子对于一些特殊的基因构建效果很差，第二条链有时候出不来，最新的meker公司的以及invirogen的topo的方法一、保证获得数量足够的高质量的起始rna。构建cdna文库要求的rna量比做race和northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mrna后进行反转录，这比直接采用总rna进行反转录而构建的cdna文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本clontech的smart 4的中级柱子要求纯化后的总mrna量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总rna量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总rna也可以构建cdna文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始rna太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于rna的质量，如果采用纯化总mrna后反转录，则对总rna的杂质方面要求稍松，但对rna的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总rna进行反转录，则对总rna的质量要求非常高，不仅要求rna相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、**胍等杂质少，最好是试剂盒**的。二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建cdna文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的rna变成了不易降解的cdna。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mrna被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mrna未被反转；二是只有少部分mrna被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mrna没有反转录完全，总的全长cdna太少，这就难以构建好的全长cdna文库。少量程度的mrna降解或反转录不完全在smart 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、rna接头连接后再反转录的新技术（可参考其generacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cdna的最好方法，但对mrna的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和poly a结构的全长mrna且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cdna的浓度及分子量分布是很重要的。这篇文章很好，在vip中可以查到，今天学校数据库上不去，你自己找找看把几种全长cdna文库构建方法比较毛新国，景蕊莲，孔秀英，赵光耀，贾继增 **农业科学院作物科学研究所，农作物基因资源与基因改良**重大科学工程，**作物种质资源与生物技术重点开放实验室,北京100081 摘要全长cdna文库是高效、大规模获得基因全序列信息的一条有效途径，尤其是对基因组庞大，近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说，是一条开展功能基因组研究的重要途径。本文对几种全长cdna文库的构建方法进行了概述，针对各种方法的原理及优缺点做了分析、比较，并结合本实验室的结果，重点介绍了cap-trapper法在小麦全长cdna文库中的应用及文库中全长基因比例判定方法。 national key facility for crop gene resources and genetic improvement, key laboratory of crop germplasm & biotechnology/the min**try of agriculture, institute of crop sciences, chinese academy of agricultural sciences, beijing 100081, chinaabstractfull-length cdna library ** the cornerstone to find new genes in high-throughput manner, especially in huge genome organ**ms that cannot carry out whole genome sequencing. in th** review, the authors compared the theories and characters of several cdna construction methods, and introduced cap-trapper method and standard to judge full-length cdna in detail according to the utilization of th** method in wheat full-length cdna construction. 20210311

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